Embriologi Sistem Peredaran Darah

Vessel and Blood Specification Override Cardiac Potential in Anterior Mesoderm

RINGKASAN
Organ progenitor timbul dalam bidang organ, wilayah embrio yang lebih besar dari daerah asal terbantuknya diperlukan pembentukan jantung. Di sini, kita mengidentifikasi mekanisme peredaran darah dalam pembatasan ukuran jantung melalui proses perkembangan bidang jantung. Jantung progenitor dalam ekspresi hand2 pada lapisan embrional mesoderm menunjukkan bahwa potensi hand2 berdiferensiasi dengan jantung di daerah ini. Di luar batas rostral dari ekspresi hand2, ditemukan dari pembuluh darah progenitor. ketidaksempurnaan embrio pada pembuluh darah menyebabkan mesoderm rostral mengalami transformasi dan menghasilkan kardiomiosit ektopik. Oleh karena itu, induksi spesifikasi pembuluh darah digunakan sebagai spesifikasi jantung serta pembatasan ruang jantung. Hubungan regulasi antara jalur kardiovaskular menunjukkan cara baru untuk diferensiasi sel progenitor . Untuk mengidentifikasi mekanisme yang membatasi spesifikasi jantung di dalam ruang jantung menggunakan peta nasib ALPM zebrafish, sehingga ditetapkan batas-batas Hfr zebrafish yang sesuai dengan batas-batas ekspresi hand2. Mesoderm luar batas rostral dari ekspresi hand2 biasanya menimbulkan garis keturunan pembuluh darah.

PENDAHULUAN
Produksi jumlah sel progenitor mempengaruhi organogenesis, Menurut (Huxley dan Beer De, 1934; Jacobson dan Sater, 1988):
1. Kekurangan dari organ progenitor yaitu membatasi ukuran organ dan kapasitas fungsional
2. Kelebihan dari organ progenitor yaitu dapat menyebabkan pembesaran organ dan ketidakfungsian. Organ progenitor diperkirakan timbul dalam bidang”organ,”wilayah embrio yang memiliki potensi pembangunan yang tepat namun biasanya lebih besar dari daerah untuk berkontribusi organ. Oleh karena itu, kuantitas nenek moyang mungkin dikendalikan oleh pembentukan batas-batas ruang dengan bertahap untuk memperbaiki potensi ruang. Namun demikian, pengaturan proses ini belum dipahami dengan baik.
• Menurut (Laflamme dan Murry, 2005; Laake van et al, 2006.) yaitu Terapi selular bertujuan meregenerasi otot jantung
• Menurut (Harvey, 2002; Yutzey dan Kirby, 2002) yaitu Studi pemetaan Nasib telah menunjukkan bahwa jantung prgenitor berada dalam bilateral daerah bentuk jantung (HFRs) dari plat mesoderm lateral anterior (ALPM)
• Menurut (Raffin et al, 2000;.. Serbedzija et al, 1998) yaitu HFRs adalah sumber utama dari kardiomiosit yang membentuk tabung jantung awal. Dalam Xenopus dan zebrafish, HFRs adalah sumber mesodermal dari kardiomiosit
• Menurut (Buckingham et al, 2005;. Kelly et al, 2001;. Mjaatvedt et al, 2001.; Waldo et al, 2001; Cai et al, 2003;.. Zaffran et al, 2004) yaitu Embrio Ayam dan tikus mengandung kedua sumber kardiomiosit yang terpisah di dalam mesodermal . Daerah kedua, atau anterior, ruang jantung, menyebabkan terbentuknya miokardium ke arah arteri dan kutub vena pada jantung , termasuk menyebabkan terbentuknya saluran keluar, ventrikel kanan, dan atrium
• Menurut (Sater dan Jacobson, 1990; Raffin et al, 2000;. Garriock dan Drysdale, 2003) yaitu Pada katak dan ikan, ALPM di sekitar HFRs muncul untuk menunjukkan luasnya potensi perkembangan yang diharapkan dari bidang organ. Dalam Xenopus, jaringan yang punah dari bagian lateral ALPM dapat menghasilkan kardiomiosit secara in vitro, meskipun ini merupakan daerah tertentu tetapi biasanya tidak menghasilkan kardiomiosit in vivo.
• Menurut (Goldstein dan Fishman, 1998) yaitu Dalam zebrafish, penghapusan notochord bagian anterior memungkinkan spesifikasi jantung di ALPM hanya untuk ekor HFRs
• Menurut (Serbedzija et al, 1998.) yaitu Penelitian ini menunjukkan bahwa potensi kardiogenik dari ALPM meluas di luar batas-batas HFRs asli.
• Menurut (Keegan et al., 2005; Collop et al., 2006): Sinyal asam retinoat muncul untuk membatasi spesifikasi jantung progenitor selama tahap-tahap gastrulasi pada zebrafish dan Xenopus
• Menurut Osmond et al, 1991;. Yutzey et al,. 1994; Drysdale et al, 1997) : Untuk menghambat diferensiasi kardiomiosit dalam ALPM di Xenopus dan chick

PROSEDUR PERCOBAAN
1. Mutasi, Morpholinos, dan Suntikan RNA
Untuk menghasilkan embrio mutan, dengan cara menyilangkan individu yang mempunyai sifat heterozigot untuk mendapatkan mutasi hans6 (Yelon et al, 2000.), clos5 (Field et al., 2003), dan closk4. Alel closk4 diisolasi sebagai mutasi spontan pada zebrafish ; mutan closk4 secara fenotip tampak identik dengan mutan clos5. Semua MOS yang digunakan dalam penelitian yang sebelumnya terbukti cukup efektif dan spesifik (Juarez et al, 2005.; Sumanas dan Lin, 2006). Untuk menurunkan kadar SCL, dengan menyuntikan 12,5 ng dari campuran 02:03 dari E2I2 dan MOS anti-SCL E3I3 (Juarezet al, 2005). Untuk menurunkan etsrp, dengan menyuntikkan 12 ng dari campuran 1:1 anti-etsrp MO1 dan MO2 (Sumanas dan Lin, 2006). Untuk mendapatkan anti-SCL + etsrp MOS, dengan cara menyuntikkan 12 ng dari kombinasi 1:1 dari campuran yang diuraikan di atas. Sebelumnya telah dijelaskan bahwa plasmid yang berperan dalam mensintesis SCL dan etsrp RNA (Dooley et al, 2005;. Pham et al, 2007.). Embrio yang disuntik dengan kombinasi 40-50 ng RNA SCL dan 4-8 ng dari etsrp RNA; menghasilkan variabel dan fenotipe mosaik tapi mencegah toksisitas dan malformasi berat.

2. Hibridisasi in situ
Sepasang riboprobes, riboprobes pertama berlabel digoksigenin (DIG) dan lainnya berlabel dinitrophenol (DNP). DNP disintesis sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya (Long dan Rebagliati, 2002) menggunakan Label DNP- Ini kit (Mirus). DNP digunakan untuk memperluas inkubasi sampai 2,5 jam dengan menggunakan 1,5 ml pelabelan pereaksi per mg
RNA. Setelah melakuakn hibridisasi, pencucian, dan penyegelan, embrio diinkubasi semalaman pada suhu 4oC dengan menggunakan anti-DNP anti-DNP Fab fragments hasil konjugasi dari peroxidase (HRP) tanaman lobak (PerkinElmer; 1:400 dilusi). Embrio kemudian diinkubasi dengan tyramide DNP (PerkinElmer; 1:25 pengenceran, 30 menit pada suhu ruang) untuk memperkuat deposisi DNP. Selanjutnya, digunakan kondisi yang kuat untuk memastikan pelepasan HRP. Embrio dicuci dalam PBT (PBS, 0,1%-Tween 20) yang mengandung 3% peroksida (empat kali, 15 menit per cuci), kemudian glisin 0,1 M (PH 2.2) dengan 0,1% Tween-20 (empat kali, 15 menit per cuci). Akhirnya, embrio dicuci di PBT, disegel, dan diinkubasi semalam pada 4oC dengan fragmen Fab anti-DIG konjugasi HRP (Roche; 1:400 dilusi). Embrio kemudian diinkubasi dengan fluorescein (FLU) tyramide (PerkinElmer), diikuti dengan penghilangan HRP, seperti di atas. Selanjutnya, dilakukan putaran kedua deposisi tyramide. Embrio pertama kali diinkubasi dengan fragmen Fab anti DNP HRP-terkonjugasi, inkubasi followedby dengan tyramide Cy3 (PerkinElmer; 1:25 pengenceran, 30 menit pada suhu ruang). Setelah penghapusan kegiatan HRP, embrio diinkubasi dengan fragmen Fab anti-FLU HRP-terkonjugasi, diikuti dengan inkubasi dengan tyramide FLU. Setelah set akhir mencuci PBT, embrio disimpan dalam larutan Antifade SlowFade Invitrogen).

3. Photoactivation Flourescent di ALPM
Dekstran fluorescein disimpan, disiapkan dan disuntikkan seperti sebelumnya dijelaskan (Keegan et al, 2004.), dengan pengecualian yang disuntikkan langsung ke dalam sel embrio yang baru dibuahi. Ketika embrio telah disuntikkan mencapai tahap somite 6-9, daerah embri yang berada di daerah dorsal dimasukkan ke dalam agarose2% dan diisi dengan air embrio.
flourescent adalah foto yang diaktifkan di dalam kelompok 10-15 sel ALPM oleh paparan gelombang 1s dari laser 375 nm nitrogen berdenyut (Micropoint Laser System, Instrumen Foton). Sinar laser difokuskan dengan tujuan melalui pencelupan 403 air pada mikroskop Axioplan Zeiss 2 yang dilengkapi dengan kamera pendingin CCD (Pentamax) dan jendela otomatis (Uniblitz). Untuk label ALPM lateral, kami menghindari pelabelan sel yang terletak lebih dari empat lebar sel dari tepi lateral ALPM. Untuk label ALPM medial, kita berlabel sel yang paling sedikit empatsel lebar interior ke tepi lateral ALPM tersebut.

4. Deteksi flourescent dan Pemberian Nilai Sel yang Dilabeli
Pelabelan embrio terpusat pada tahap yang diinginkan: (Angka 2E, 2F, 2H, dan 2I), pada 30 HPF (Angka 4G dan 4H), atau di 44 HPF (Angka 2j-2L dan 5L). Mutan Clo ditentukan pada 44 Hpf, yang merupakan tahap standar laboratorium untuk menilai sel yang telah diberi label(Keegan et al, 2004.). Namun, mutan han tetap ditentukan pada 30 HPF, sebagai mutan miokardium, han tetap berada di bawah otak belakang pada 44 HPF dan karena itu dikaburkan oleh pigmentasi. Data tipe-Wild merupakan kombinasi dari embrio
tetap pada 30 dan 44 HPF. Setelah difiksasi, embrio diproses oleh hibridisasi in situ
untuk membuat counterstain untuk mendeteksi fluorescein. Untuk embrio tetap pada
30 dan 44 HPF, ekpresi cmlc2 divisualisasikan sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya
(Keegan et al, 2004.) dengan menggunakan substrat 5-bromo-6-kloro-3-indolyl fosfat (phos magenta, B-5667, Sigma). Sel berlabel dengan fluorescein kemudian dideteksi oleh imunohistokimia untuk kontribusi jaringan berdasarkan lokasi, morfologi, dan counterstaining, sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya (Keegan et al, 2004.). Dalam fakta tertentu, kami menggunakan kriteria morfologis untuk membedakan miokardium
sel, yang berbentuk relatif bulat dan cenderung berorientasi disekitar jantung, dari sel-sel endocardial, yang relatif memanjang dan cenderung longitudinal. Selain itu, kami menilai daerah sel berlabel relatif terhadap counterstain miokardium. Jumlah progeni berlabel terdeteksi bervariasi antara embrio individu. Kontribusi untuk kantong faring berkisar antara 5 dan 50 sel dan kontribusi untuk miokardium atau endocardium berkisar antara 1 dan 30 sel. Untuk embrio tetap setelah berlabel, kami menggunakan dua-warna
fluorescent pada teknik hibridisasi in situ untuk counterstain untuk ALPM spidol (SCL atau nkx2.5) dan untuk mendeteksi keberadaan fluorescein bebas. Secara singkat, DIG riboprobe terdeteksi dengan fragmen Fab anti-DIG HRP-terkonjugasi, diinkubasi dengan tyramide DNP, dan kedua deposisi tyramide dengan fragmen Fab anti-DNP HRP-terkonjugasi dan tyramide Cy3. Kemudian, fluorescein yang beabs terdeteksi dengan anti-FLU HRP terkonjugasi Fab fragmen dan reaksi tyramide FLU, dengan opsional putaran kedua endapan tyramide.

5. Menghitung kardiomiosit
Untuk menghitung kardiomiosit, denggan menggunakan transgenic Tg (cmlc2: DsRed2-Nu (Mably et al, 2003).Embrio transgenik menggunakan standar immunofluorescence
protokol (Alexander et al, 1998.), antibodi utama S46 (anti-AMHC; 1:20; Studi Pembangunan hibridoma Bank) dan anti-DsRed (1:4000; Clontech), dan antibodi kedua yaitu dari kambing anti- tikus IgG1 FITC (1:100; Selatan Bioteknologi Associates) dan keledai anti-kelinci Alexa 594 (1:1000; Invitrogen). Kemudian dihitung inti merah fluorescent pada setiap ruang jantung.

6. Mengambil gambar
Fluorescent dalam gambar hibridisasi in situ ditangkap dengan Zeiss LSM mikroskop 510 confocal dan diproses dengan Zeiss LSM 510 dan Adobe Photoshop 7 perangkat lunak. Penangkapan DIC dan gambar FITC embrio hidup yang dikendalikan oleh perangkat lunak Sistem metamorf Imaging (v6.1r3, Universal Imaging). Semua embrio lain difoto
dengan Zeiss M2Bio dan mikroskop Axioplan dilengkapi dengan Zeiss Axiocam kamera digital, gambar diproses dengan Zeiss AxioVision (v3.0.6) dan Adobe Photoshop 7 perangkat lunak.

HASIL
1. Pola ekspresi gen membagi menjadi tiga wilayah ALPM.
Untuk menyelidiki mekanisme yang membatasi ruang jantung pada zebrafish, pertama menentukan dimensi Hfr terhadap pola ekspresi gen di ALPM zebrafish. Kami memilih untuk memeriksa ekspresi sekelompok gen faktor transkripsi pada tahap somite 6-9 Pada tahap ini, ALPM muncul sebagai strip bilateral yang bermigrasi sepanjang tepi lateral dari sumbu anterior-posterior embrio. Sedikit gen yang diambil (misalnya gata4, gata5, dan tbx20).
Kardiomiosit ektopik timbul dari ALPM rostral di mutan Clo. Meskipun Hand2 tampaknya tidak berpengaruh pada spesifikasi jantung, ekspresi hand2 menjadi penanda yang berguna menentukan lokasi Hfr tersebut. Hipotesis kami menyatakan bahwa gen penting untuk membatasi potensi perkembangan jantung yang akan mengatur tingkat ekspresi hand2. Karena itu kami melanjutkan untuk menganalisis ekspresi hand2 dalam kumpulan ikan zebra mutan yang mengalami cacat jantung dan kami menemukan bahwa mutasi pada lokus (Clo) memiliki efek yang terlihat. Secara khusus, kami menemukan bahwa ekspresi hand2 dalam mutan Clo melampaui batas normal dan menunjukkan ekspresi yang kuat di seluruh ALPM rostral. Gen Clo diperlukan untuk spesifikasi garis keturunan endotel dan hematopoietic. Hal ini mungkin mencerminkan peran penting dari sinyal endocardial-miokard selama pematangan ruang ventrikel dan pertumbuhan, setelah bumbung jantung terbentuk. Secara keseluruhan, data peta nasib jelas menunjukkan suatu transformasi nasib dalam ALPM rostral mutan Clo bukan memproduksi progenitor garis keturunan endotel dan hematopoietik, wilayah ini menghasilkan progenitor miokardial ektopik. Oleh karena itu, Clo bertindak sebagai represor spesifikasi jantung di ALPM rostral.
SCL dan Etsrp merupakan komponen penting dari program rostral spesifikasi vasculogenic dan myelopoietic. Selain itu, overekspresi ini dapat menginduksi ekspresi gen ektopik pembuluh dan darah lebih lanjut, overekspresi SCL bersama-sama dengan lmo2 menginduksi luas, pembuluh ektopik dan spesifikasi darah dengan mengorbankan mesodermal lain tipe sel, termasuk miokardium. Untuk menentukan apakah SCL dan etsrp diperlukan untuk menekan cardiogenesis, sebelumnya kita gunakan anti-SCL dan morpholinos anti-etsrp (MOS) untuk merobohkan fungsi gen. Embrio disuntik dengan anti-SCL atau MOS anti-etsrp ditampilkan ekspresi lemah hand2 di ALPM rostral. Injeksi kedua SCL-anti dan MOS anti-etsrp (selanjutnya disebut sebagai MOS anti-SCL + etsrp).

2. Zebrafish Hfr Memperpanjang seluruh Medial dan lateral
Hfr zebrafish meluas di ALPM medial dan lateral, dengan sedikit bantuan atau tidak ada dari ALPM rostral. Dari medial percobaan ALPM menghasilkan keturunan miokard, 96% dari embrio berlabel kardiomiosit di ventrikel, sedangkan hanya 38% dari embrio dipameberlabel kardiomiosit di atrium (Gambar 3C; Tabel 1). Penggabungan antara peta nasib dengan data ekspresi gen, disimpulkan bahwa Hfr yang sesuai dengan batas-batas ekspresi hand2. Walaupun penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi nkx2.5 menandai zebrafish yang HFRs (Serbedzijaet al., 1998), domain yang lebih besar hand2 ekspresi lebih akurat mencerminkan dimensi Hfr dan termasuk atrium nenek moyang selama tahap somite 6-9. kemudian tahap nkx2.5 dinyatakan dalam kedua ventrikel dan miokardium atrium (Yelon et al., 1999).

KESIMPULAN
Untuk mengidentifikasi mekanisme yang membatasi spesifikasi jantung di dalam ruang jantung menggunakan peta nasib ALPM zebrafish, sehingga ditetapkan batas-batas Hfr zebrafish yang sesuai dengan hand2 batas-batas ekspresi dengan menggunakan berbagai metode diantaranya adalah Mutasi, Morpholinos, dan Suntikan RNA ; Hibridisasi in situ ; Photoactivation Flourescent di ALPM ; Menghitung kardiomiosit ; Mengambil gambar. Diperoleh hasil yaitu ALPM dibagi menjadi tiga wilayah oleh ekspresi gen dan peta Zebrafish ini memperpanjang seluruh wilayah Medial dan Lateral. Dengan peralatan yang cukup canggih seperti yang dipaparkan pada jurnal tersebut, maka berbagai ekspresi gen dapat terlihat aktifitasnya sehingga mereka dapat mengetahui mekanisme pembatasan ruang jantung oleh sel pengarah (progenitor) dengan berbagai reaksi atau perlakuan yang diberikan.

SARAN
a. Dari penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan dalam transplantasi jantung di bidang kedokteran atau medis.
b. Pada penelitian selanjutnya dapat meneliti pada aspek lainnya tidak hanya tertuju pada ekpresi gen yang membentuk ruang-ruang jantung.

About these ads

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

Ikuti

Get every new post delivered to your Inbox.

%d bloggers like this: